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qpcr数据造假会被看出来吗（硕士毕业论文数据全是编的）
发布时间：2023-05-26 22:08:31
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创意岭 阅读：
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大家好！今天让创意岭的小编来大家介绍下关于qpcr数据造假会被看出来吗的问题，以下是小编对此问题的归纳整理，让我们一起来看看吧。
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pcr平台期不一致
技术文章干货分享|qPCR复孔平台期荧光信号不同会影响实验结果吗？
翌圣生物科技（上海）股份有限公>> 进入商铺
2020/10/17 9:51:48
干货分享|qPCR复孔平台期荧光信号不同会影响实验结果吗？
王老师：您好，近用你们的试剂跑qPCR，复孔平台期的荧光信号不同，这样的结果能用吗？
小翊：您好，老师。从图中来看，复孔重复性是比较好的，△Ct值<0.5, 这个结果没什么问题的。
王老师：那为什么复孔的平台期信号还有相差呢？有什么方法可以使复孔荧光信号一致吗？
近有不少客户咨询小翊类似的问题，担心这样的数据不可靠今天小翊就帮您解除疑虑！
复孔平台期不同不会影响实验结果（△Ct<0.5）
*，理想的PCR扩增是使DNA分子由1变2，2变4，以2n进行扩增的。但实际上，随着循环数的增加，体系中的Taq酶、dNTP、引物等逐渐被消耗并伴随着副产物的生成，使得PCR不能呈指数扩增，从而使实际的扩增曲线呈现“S”型，通常分为基线期、指数增长期和平台期三个阶段，如图1。
基线期是指PCR开始的3-15个循环时期，这段时期扩增是存在的，但因循环次数较少，体系中双链DNA积累较少，荧光信号强度没有超过荧光本底信号，此时的荧光值对于机器来说很难准确检测。指数扩增期是指PCR产物的量增长//快的一个时期，理想条件下，是呈指数增长的，在这个时期由于样品间的细小误差尚未放大，所以复孔的荧光信号在这个时期相对一致。通常荧光阈值需要设置在此时期，荧光信号达到荧光阈值所经历的循环数称之为Ct值，故各复孔间的Ct值有较好的重复性（△Ct＜0.5）。而平台期是指由于原料耗尽、反应副产物的产生等原因使得扩增变得缓慢的一个时期。此时期经过的循环次数较多，使样品间的细小差异被无限放大，从而导致复孔间平台期的荧光信号相差很大。
图1 扩增曲线的三个阶段
下面为大家展示一个案例，以293T-cDNA的20倍稀释液为模板，扩增GAPDH基因，90个复孔（如图2）。
图2 同一样品的90个重复的扩增曲线图
由图可以看出该实验的复孔重复性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE标准。但平台期的荧光信号值均有差异。
综上：数据的有效性和复孔平台期荧光信号关系不大，主要与复孔间的△Ct有关，MIQE标准是△Ct＜0.5。
在复孔△Ct<0.5的情况下，复孔平台期不同并不影响实验结果，但是有没有办法可以让复孔平台期荧光信号尽量一致呢？
使复孔平台期荧光信号趋于一致的秘诀
1、确保加样的准确性
1）qPCR各组分*化冻需要混匀。
2）采用预混的方式进行加样，保证体系的均一性。可以将除模板以外的试剂进行预混，分注至各管中。
3）模板浓度高时，可将模板稀释，提高加样体积，减少加样误差。
2、确保移液的精///准度
加样过程需确保移液枪未出现漏气、漏液的情况，避免使用精///准度差的移液枪或者不配套的枪头。
3、体系混匀并进行离心
体系加完后要用移液枪吹打并进行离心，以防试剂挂壁或者体系中有气泡造成实验结果不准确。
4、qPCR试剂的选择：选择“预混液”形式的qPCR试剂，反应体系只需加入引物和模板，大大简化实验的操作步骤，减少了加样误差。
好了，读到这里，您应该不会再用纠结复孔平台期荧光信号不同的事了吧？为了简化您的qPCR实验操作，让您的qPCR数据更完美，小翊为您推荐一款SYBR Green预混液：Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat 11184ES），该产品是预混液形式的qPCR试剂，另外适合于所有的qPCR仪器平台（如图3），兼容快速程序，可以大大简化您的实验操作并能保证您实验结果准确性。
图3. 适合于所有的qPCR仪器平台
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如果一个基因没有表达，realtimeqpcr会测出来吗
如果一个基因没有表达，realtimeqpcr会测出来一般来讲，进行real-timeqPCRMasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-timeqPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1.MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2.的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3.每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4.所有成分加完后，离心去除气泡。5.每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（referencedye，passivedye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。
参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。3.仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（platesetup）和程序设置（programsetup）。
以上就是关于qpcr数据造假会被看出来吗相关问题的回答。希望能帮到你，如有更多相关问题，您也可以联系我们的客服进行咨询，客服也会为您讲解更多精彩的知识和内容。
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